近日，CoolLED与 Scientifica 合作制作了全新白皮书，旨在为您介绍有关神经科学研究的小技巧，通过现有的最新技术以高性价比捕获具有高信噪比的快速事件。Scientifica是一家专门提供针对电生理学(electrophysiology)、多光子成像(multiphoton imaging)和光遗传学(optogenetic)研究的优化尖端设备的公司。
详细捕捉快速事件的能力对于推动神经科学研究的新发现而言至关重要。然而，随着显微镜技术日益先进，在实验室预算内实现高时间分辨率的权衡却可能困难重重。此外，如今LED 显微镜照明已经颠覆了传统的高速成像与光遗传学刺激方法。为此，我们希望能够为您提供更新的介绍与指引，以帮助神经科学从业者进一步了解哪些滤光片、光源与其他组件会与其设置最匹配。
本篇白皮书将为您介绍：
哪种宽场照明技术组合可以实现 <7 μs 的成像速度 ?
单个荧光激发块(filter cube)是如何足以用于多重荧光成像 ?
为速度与对比度选择滤光片时应考虑什么?
宽场荧光显微镜(Widefield fluorescence microscopy)是分析活样品中动态事件时常用的选择方法。虽然共聚焦激光扫描(confocal laser scanning)技术具有光学切片的优势，但图像采集速度却受到扫描过程的限制，因此宽场设置有望提供更高的时间分辨率。此外，研究人员也可以通过使用图像处理软件工具作为去卷积(deconvolution)来简单地增强对比度;或者通过转盘共聚焦系统(spinning disk confocal system)来获取具有宽场荧光速度的光学切片——这两种方法都受益于 LED 照明技术。
除了更详细地捕获生物过程之外，高速成像还提高了比率荧光测量的准确性，例如在执行 Fura-2 钙成像时。在将成像与光遗传学相结合时，速度也是一个优势。
宽场荧光成像装置的最大速度由几个组件决定，但在决定如何优化高速成像装置时，照明系统经常被忽视。现在这种情况正在发生变化，过去十年 LED 光源和滤光片组件的突破现在使得使用宽场显微镜达到 7 μs 以下的速度成为可能。
高速LED照明
与用于宽场荧光显微镜的传统汞灯和金属卤化物灯不同，LED 照明系统是电子控制的。避免由于物理快门导致的延迟(每次曝光可能高达 20 毫秒)是高速成像的关键。然而，研究人员也需考虑其他因素才能充分发挥电子控制在图像采集中的速度潜力，尤其是在一个样品中多路复用荧光团(multiplexing fluorophore)时。
光源的 TTL 控制：当通过成像软件操作照明系统时，USB 串行通信与计算机操作系统开销会引入延迟，使 LED 开/关速度降低多达 100 毫秒。当将成像与其他技术相结合时，这也可能会影响系统同步。通过如 TTL 脉冲等信号进行数字控制是 LED 照明系统(例如：CoolLED pE-800fura)能够实现低于 7 μs 的速度的关键方式——但这需要例如 USB 控制的 TTL 触发盒等特殊组件。最简单的 TTL 控制方法是序列运行设置(在您的 CoolLED 照明系统上可用)，它使用大多数科学相机或其他硬件上可用的 TTL 输出信号，并以用户选择的每个 TTL 信号顺序循环 LED。有时，您可以对辐照度进行模拟控制，这在例如“在严格定时的实验方案中调整光遗传学刺激的功率”等情况下是十分有益的。
滤光片：多重荧光成像中的一个常见误解是速度与对比度两者不可兼得。安装在电动荧光激发块转轮( motorised filter cube turret)中的单波段荧光激发块能够为实验提供高对比度但速度相对较低，而多波段滤光片组能够提供高速但低对比度。
然而，具有独立通道切换功能的现代 LED 照明系统在与 Pinkel 滤光片配置一起使用时能够实现速度与对比度的两全其美——同时需使用单波段激发滤光片、多波段发射滤光片和多波段二色镜。当单波段激发滤光片在每个单独的 LED 通道前被安装于照明系统本身时，容纳多波段滤光片的荧光激发块可保持静止，并同时消除系统的机械延迟。随后，速度将仅受 LED 通道切换速度的限制，如前所述，该速度可快至 7 μs 以下。
研究人员将无需使用荧光激发块转轮，可转而使用专为所需设置设计的紧凑型荧光激发块模块——例如为神经科学显微镜专门设计的 Scientifica 低振动荧光激发块模块。这是对 LED 照明系统的完美补充，包括内部激发滤光片支架、独立通道控制与高速 TTL 触发。然后只需要为不同的应用或研究填充三个荧光激发块即可——因为一个 Pinkel 滤光片组足以为多个荧光团实现成像，例如用于成像 DAPI、FITC、TRITC 和 Cy5 的 Chroma Quad band 89404。
图 1：使用多重宽场荧光显微镜实现高速、高对比度成像的创新。用于神经科学应用的 CoolLED pE-800fura LED 照明系统可通过 TTL 触发达到 <7 μs 的速度。该速度是通过结合在所有八个通道间单独切换的能力 (a) 和使用以 Pinkel 配置排列的内部激发滤光片(inline excitation filter) (b) 以及安装在 Scientifica FCM 中的多波段发射滤光片和二色镜来实现的。
聚焦于滤光片
与激光不同，每个 LED 通道都具有更广的光谱，这意味着它们可以提供更广泛的荧光团覆盖范围。LED 光源很可能与未来出现的新荧光团兼容，例如可降低光毒性的红移染料(red‐shifted dye)。然而，这也意味着 LED 的光谱需要通过使用滤光片来仔细调整荧光团。当使用多波段滤光片时，这也是一个更大的考虑因素，研究人员需仔细选择，以避免泄漏(也称为串扰 )与信噪比降低。此外，我们还为更复杂的研究需求，围绕传统金属卤化物光源设计了许多滤光片。
并非每个人都有时间分析光谱数据，以便仔细地将滤光片与其照明系统和荧光团组匹配，您可以选择更简单地使用在线工具，例如：
CoolLED 滤光片查找工具：查找针对 LED 照明系统优化的 Semrock 和 Chroma 滤光片
Chroma Spectra Viewer：查找滤光片并对滤光片与荧光团光谱可视化
FPbase：可视化荧光团、滤光片、光源与检测器
如今，LED 显微镜照明已经颠覆了用于神经科学的高速成像与光遗传学刺激的传统方法，而哪些滤光片、光源和其他组件适合每个单独的设置的问题却可能引起困惑。本文旨在为您提供基础的解决方案，但如果您想了解更多信息或有任何疑问，请联系我们。
15083844965